REGULACIÓN DE LAS VÍAS CATABÓLICAS

En esta sección vamos a comentar como se regulan y que elementos reguladores intervienen en las vías catabólicas y concretamente nos vamos a centrar en las vías degradativas de compuestos aromáticos.
Para empezar es importante tener en mente que los genes que codifican para enzimas o proteínas reguladoras que intervienen en una vía catabólica suelen encontrarse agrupados en estructuras llamados clusters. Estos clusters suelen estar organizados de manera que una zona promotora regula a la vez la transcripción de varios genes relacionados ( como puede ser los de una vía catabólica). A veces en lugar de encontrar solo una unidad transcripcional, podemos encontrar varias unidades transcripcionales como se verá mas adelante en un ejemplo.

En principio de forma general sobre los promotores de operones catabólicos podemos encontrar dos niveles de regulación esquematizado en la figura de abajo:

1-Un primer nivel sería a partir de unas proteínas reguladoras sensibles a señales externas. Estas señales externas se podría tratar del sustrato que la vía degrada o bien un metabolito intermediario producido en esta vía de degradación y serían las responsables de inactivar o activar mediante la inducción de cambios conformacionales esas proteínas reguladoras. Por otra banda estas proteínas reguladoras específicas para una señal sobre el promotor pueden tener una función como activador transcripcional o bien tener actividad represora. De esta manera modelaríamos la actividad del operón según si hay o no sustrato para utilizar en el medio. Comentar también que la mayoría de reguladores actúan de activadores, a parte que la mayoría de represores forman parte de la família GntR.
Antes de comentar profundamente los tipos de reguladores que existen decir que los promotores de estas vías catabólicas no son muy específicos, por lo que podrían actuar diferentes reguladores (siempre regulados por la señal externa) aumentando la posibilidad de aparición de nuevas vías regulables. Sin embargo como vamos a ver a continuación si existen una gran cantidad de reguladores y que además divergen bastante evolutivamente entre ellos. También decir que la mayoría de información de estos reguladores se ha obtenido del genero Pseudomonas, sobretodo P.putida que es muy utilizada en biorremediación. También son importantes en biorremediación los géneros Ralstonia y Acinetobacter.
(apretar aquí para observar la diversidad de reguladores para vías catabólicas de compuestos aromáticos).

Según las características moleculares de los reguladores se ha intentado hacer una clasificación de estos en diferentes famílias nombradas a continuación:

1-	Familia NtrC
2-	Familia LysR
3-	Familia AraC
4-	Familia IcIR
5-	Familia FNR
6-	Familia MarR
7-	Familia GntR
8-	Familia TetR
9-	Familia de transducción de señales en dos componentes.( TCST)

Para obtener información específica de las características propias de cada familia se recomienda leer el siguiente review , del cual me he basado para hacer esta sección.

¨ Para ilustrar la variedad de reguladores de estas vías y como están relacionados entre ellos se ha propuesto hacer un árbol filogenético donde se muestren algunos de los componentes de cada familia y ver así como estas familias han evolucionado y que relaciones tienen entre ellas. En este estudio se ha intentado coger dos representantes mínimos de cada familia y se ha intentado que estos reguladores proviniesen de la misma especie para evitar así diferencias interespecíficas. Como se podrá observar la mayoría de reguladores escogidos provienen de Pseudomonas putida. Cuando no ha sido posible encontrar un representante de esta especie se ha intentado que al menos fuera del genero Pseudomonas. No ha sido así en todos los casos.
Para la realización del árbol como outgroup se ha cogido también un regulador fágico muy conocido como el represor CI que interviene regulando el ciclo lítico.
Antes de ver los resultados decir que el alineamiento múltiple ( ClustalW) entre los diferentes reguladores para construir el árbol filogenético se ha hecho a nivel de proteína por varias razones.
Una es que las clasificaciones por familias como esta que depende de características moleculares se suelen hacer a nivel proteico y otra razón es para evitar la degeneración de código que encontríamos si se hiciera a nivel de DNA, aunque en este caso al ser especies muy similares o incluso la misma tampoco seria tan importante este factor (me refiero a la utilización de codón).

En la siguiente tabla se han representado los reguladores que se han escogido para el alineamiento indicando a que familia pertenecen. Pulsando sobre los reguladores se puede obtener la información a nivel proteico del genbank (NCBI).

NOMBRE REGULADOR	FAMILIA
xylR , pheR , phhR, tmbR	NtrC
nahR (P.putida), nahR (P.stutzeri)	LysR
xylS , ipbR	AraC
pcaR, ohbR	IcIR
todS, todT	TCST
hbaR, aadR	FNR
hpcR, badR	MarR
CymR	TetR
vanR , paaN	GntR

        ¨También se ha hecho un BLAST del gen XylR ( familia NtrC)a nivel génico. Como se puede observar la mayoría de sequencias con quien tiene similitud son genes relacionados con vías catabólicas de compuestos aromáticos. Además la mayoría de secuencias también forma parte de especies degradadoras de hidrocarburos como Pseudomonas, Ralstonia,Camamonas etc...
Es de destacar la gran similitud que tiene con un regulador dependiente del factor s-54 de Xanthobacter (gi|19068124|gb|AY055852.1|) que es del 100%.Evidentemente el 100% se trata de una secuencia muy corta pero que seguramente se trate de una zona conservada para un dominio que interviene en la unión con el factor s-54. De hecho esta familia NtrC se caracteriza por tener un dominio de unión a este factor s-54 y como se puede ver en el blast xylR tiene similitud con varias secuencias de varias especies que tiene que ver con este factor. De hecho hibrida casi siempre la misma secuencia que es la siguiente:

                                                            Query: 1342 tggccaggcaatatccgcgagctggagaacg 1372

                                                            Sbjct: 2837 tggccgggcaacatccgcgagctggagaacg 2867

A parte, en el blast como cabía esperar también se puede observar que tiene similitud con varios miembros de la familia NtrC como los genes tbuT ( Ralstonia picketti), pheR ,phhR y tmbR (P.putida), aphR y phcR (Camamonas testosteroni),phhR y tmbR etc... y casi siempre por esta región de 1342 y 1372 del xylR.

¨ Por acabar con el estudio de estos reguladores he querido hacer un estudio especial de la familia NtrC. Ya hemos visto que a nivel de DNA tienen una secuencia que seguramente codifica para un domino importante de unión al factor s-54. Pero para estudiar mas profundamente que otras zonas conservadas tiene esta familia he hecho otro alineamiento múltiple (clustalW) pero solo de cuatro miembros de la familia y a nivel proteico. Los reguladores elegidos para el clustalW son pheR, phhR, tmbR y xylR. (Como la secuencia aminoacídica encontrada antes del xylR era muy corta he buscado en el NCBI otra mayor para poder hacer una comparación para toda la proteina).
Como se puede observar en el clustalW las cuatro proteínas son muy similares ya que mantienen zonas conservadas durante toda la longitud de secuencia. Es decir mantienen una semejanza casi a nivel de proteína entera. Esto hace que sea difícil ver dominios o zonas conservadas que podamos atribuir a un dominio concreto. Aún así si podemos decir que hay zonas con una secuencia conservada mas larga. Pero si se mira la información obtenida en NCBI en el gen xylR y phhR nos dice en los dos que hay una zona o dominio correspondiente a un dominio de unión al factor s-54.Concretamente este dominio corresponde del aminoácido 235-464 en xylR y del 335-457 en phhR. Como vemos se encuentran en la misma zona teniendo en cuenta que todos empiezan por el aminoácido de inicio metionina. A demás se corresponde a lo encontrado a nivel de DNA.
A parte también nos indica que hay dos sitios centrales que podrían corresponder a un dominio con actividad ATPasica y también se encuentran en las dos proteinas en zonas similares ( entre 263-335). También en el gen xylR la información del NCBI nos dice que tiene un cuarto sitio (534-553) que podría ser un motivo HTH que tendría afinidad por el promotor. Esto raramente no sale en la información del NCBI del phhR aunque las dos secuencias tienen una longitud similar por lo que descarto que no se haya incluido esta parte en la secuencia encontrada del phhR. Todo esto indicaría que posiblemente este motivo no ha sido descrito.
Para acabar decir que todo concuerda mas o menos con las características moleculares de la familia NtrC que comenta el review. Señalan que como características de estos reguladores es que estarían constituidos por cuatro dominios. Un dominio A que seria el menos conservado porque sería el encargado de reconocer la señal externa , un domino B que uniría dominio A y C, un dominio C con capacidad ATPasica y por último un dominio D que sería el motivo HTH. También comentan por acabar que estos reguladores son dependientes o tienen afinidad también por el factor s-54-RNAP.

2-Un segundo nivel de regulación sobre los promotores catabólicos sería una regulación mas inespecífica que modelaría de alguna manera el nivel transcripcional de estos operones en función de la situación fisiológica del microorganismo en aquel momento, para así evitar gastos energéticos inútiles. Es decir si en aquel ambiente tiene el sustrato que utiliza normalmente como fuente de carbono y energía no necesitara la activación de estas vías de degradación de hidrocarburos. Decir también que estas proteínas solo favorecen o disminuyen la afinidad de la RNA polimerasa por su promotor, no activan por si solas estos operones. Siempre se requiere una activación previa por los reguladores comentados anteriormente.
Algunos ejemplos de proteínas que pueden dar lugar a esta acción modulatoria són:

1- CRP (proteína regulada por catabolito): Esta proteina modula la transcripción de la mayoría de operones catabólicos en microorganismos que utilicen glucosa como fuente de carbono como E.coli. En este caso cuando en el medio haya glucosa para fermentar esta proteína reguladora está inactivada. Cuando disminuye la concentración de glucosa en el medio se produce un aumento en la concentración de AMPc que sirve de inductor para CRP. De esta manera se aumenta la capacidad transcripcional.

2-Ccp: Esta proteína es similar a la CRP pero se encuentra en microorganismos que no pueden fermentar glucosa como Pseudomonas, que es una especie respiradora facultativa. En estas especies evidentemente no serviría regular su metabolismo en función de la glucosa ya que no la pueden utilizar. En este caso utilizan una proteína análoga que es Ccp y regula estos operones catabólicos en función de la presencia de los compuestos que suelen respirar, que son succinato y fumarato en el caso de Pseudomonas.

3.ppGpp( tetrafosfato de guanasina): Esta molécula se trata de un efector pleiotróficos y suele actuar mas concretamente sobre vías anabólicas inhibiendolas ( excepto la biosíntesis de aminoácidos) cuando el microorganismo se encuentra en una situación restringente.

5-IHF: Se trata de una proteína que moldea la curvatura del DNA favoreciendo el acoplamiento de la RNA polimerasa.

3.Ejemplo: Una vez vistos los diferentes niveles de regulación vamos a ver a continuación un ejemplo de operón catabólico para así ilustrar como funcionan estos reguladores y como se integran o relacionan los dos niveles de regulación. Se ha elegido como ejemplo el operón catabólico para el tolueno que es uno de los mas conocidos. Este operón se encuentra en el plásmido TOL (pWWO). A continuación se muestra un figura donde se esquematiza su estructura:

Como se puede observar en el esquema este operón está constituido por tres unidades transcripcionales. La primera unidad está formada por el promotor Pu y varios genes que codifican para enzimas que intervienen en la transformación de xileno a tolueno. La segunda unidad transcripcional está constituido por el promotor Pm y otra serie de enzimas que intervienen en las vías altas para la degradación del tolueno. Y por último hay una tercera unidad transcripcional donde se encuentran genes que codifican para los reguladores de este operón. En este caso xylR y xylS cada uno con su promotor, Pr y Ps respectivamente.

Una vez comentada la estructura del operón vamos a ver como se regula. Cuando en el medio hay presencia de xileno, este actúa como inductor activando el regulador xylR, el cual por una banda activa la transcripción de los genes de la primera unidad transcripcional y por otra banda también activa la transcripción del regulador xylS. Además inhibe su propia transcripción. Una vez sintetizados los enzimas de la primera unidad transcripcional estos pasan el xileno a tolueno, el cual sirve de inductor para xylS que actua activando la segunda unidad transcripcional, cuyos enzimas degradaran el tolueno.
Así grácias a esta activación progresiva se evita la producción de enzimas innecesarias cuando no hay el sustrato adecuado, como es la producción de enzimas de la segunda unidad transcripcional cuando aún no hay tolueno. Además a medida que el xileno y tolueno se va acabando se van desacoplando las diferentes unidades transcripcionales. A parte también se puede observar que sobre algunos promotores intervienen aquellos elementos moduladores comentados en el apartado 2 como diferentes factores sigma, IHF etc...

Para finalizar esta parte de regulación comentar la importancia que tiene desglosar el mecanismo exacto de como se regulan y que elementos reguladores intervienen en las diferentes vías catabólicas para hidrocarburos. Este conocimiento es esencial para así mejorar y optimizar las tecnicas de biorremediación , sobretodo si hablamos de la potencialidad que pueden tener las cepas modificadas genéticamente. El conocer como se regula un operón catabólico concreto nos puede ser de gran ayuda para disenyar nuevos sistemas mas eficaces, especificos y controlados de biorremediación, que es el handicap actual.
Para hacernos una idea de las aplicaciones biotecnológicas que nos puede ofrecer los sistemas de regulación en el apartado " papel de la ingeniería genética " se muestran algunos ejemplos.