Qué es la electroforesis bidimensional?

La electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente por dos criterios físicos. En primer lugar las proteínas son separadas en un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoeléctrico (isoelectroenfoque). Tras esta separación por carga las proteínas son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDS-PAGE). Tras la tinción del gel las proteínas aparecen formando manchas circulares (spots).



Workflow de la electroforesis bidimensional. Las células son lisadas en un medio fuertemente desnaturalizante y el extracto es sometido a isoelectroenfoque. Tras una etapa de equilibración/reducción/alquilación el gel de isoelectroenfoque es colocado sobre un gel de poliacrilamida y sometido a SDS-PAGE. Las proteínas pueden ser detectadas por varios métodos de diferente sensibilidad, aplicabilidad y complejidad técnica. Los geles son escaneados y las imágenes obtenidas, llamadas mapas bidimensionales, son analizadas mediante software especializado de análisis densitométrico. (Tomado de Pandey & Mann, 2000).


El punto isoeléctrico (pI) de un proteína es el valor específico de pH en que la carga neta de la proteína es cero, de modo que no se desplaza al aplicar un campo eléctrico. Cuando una mezcla de proteínas es introducida en un gel con un gradiente de pH, tanto los extremos N y C terminal como las cadenas laterales ionizables de las proteínas captan o liberan protones de acuerdo con el pH, de modo que la carga eléctrica global de las proteínas dependerá del pH del entorno. Cuando se aplica un campo eléctrico, todas las moléculas con carga neta positiva serán atraídas hacia el cátodo, y todas las moléculas con carga neta negativa hacia el ánodo. A medida que las moléculas de proteína se van acercando a su punto isoeléctrico irán perdiendo carga eléctrica (lo más habitual) o ganando cargas de signo contrario, hasta llegar al valor de pH en que la carga neta sea cero y las proteínas dejen de moverse: se dice que las proteínas se han focalizado, ya que todas las moléculas de una especie dada de proteína inicialmente dispersas a lo largo de todo el gradiente de pH se han concentrado en un solo punto del gradiente, que corresponde a su pI. Si una molécula difunde desde este punto, se ionizará rápidamente y será arrastrada de nuevo hasta su pI por el campo eléctrico. De aquí el nombre de isoelectroenfoque (IEF, isoelectric focusing). Los isoelectroenfoques se llevan a cabo a muy altos voltajes, de hasta 8000V en su fase terminal, y en condiciones fuertemente desnaturalizantes (ej. 8M urea) con tal de obtener la máxima resolución y los resultados más limpios y reproducibles. Desde sus inicios a finales de los años 70 los gradientes de pH utilizados en IEF eran generados mediante una mezcla compleja de pequeños polímeros con fuerte capacidad tamponante cerca de su pI, llamados carrier ampholytes (CA). Al aplicar el campo eléctrico los diferentes CA se desplazaban rápidamente a través del gel (se hacía en varillas de poliacrilamida) hasta sus respectivos pI y tamponaban el medio, generando el gradiente de pH por el cual se oritenarían las proteínas. Debido a la gran complejidad química de los CA, asociada a una gran varabilidad batch to batch, a la inestabilidad de los gradientes generados (se distorsionan con el tiempo), y a la fragilidad mecánica de los geles en varilla, los anfolitos acabaron siendo practicamente substituidos por los IPG (immobilized pH gradients). Los gradientes de pH inmobilizados son generados por la copolimerización junto con la acrilamida y bisacrilamida de un gradiente de una serie de monómeros de acrilamida derivatizados con grupos tamponantes ácidos o básicos, llamados acrylamido buffers. A diferencia de los CA los acrilamido buffers son compuestos sencillos y bien caracterizados, y su inmobilización covalente a la matriz impide la distorsión del gradiente. La matriz es polimerizada entre láminas de plástico que le dan resistencia mecánica, y tras la polimerización el gel se deseca y se corta a tiras de 3mm que se congelan a -20ºC. Otras ventajas de los IPG es su particular tolerancia a presencia de sales en la muestra durante IEF, su mucho mayor capacidad de carga, la capacidad de crear virtualmente cualquier gradiente de pH (incluso gradientes muy estrechos, de menos de una unidad de pH), y su disponibilidad comercial (Amersham Pharmacia Biotech, Bio-Rad Laboratories). El resultado de todo esto es una versatilidad y una reproducibilidad incomparables. La segunda dimensión consta de una separación SDS-PAGE convencional. Una muy buena compilación de todos estos y otros aspectos experimentales puede encontrarse en Berkelman & Stensted, 1998, y Görg et al., 2000. Existe una gran variedad de métodos de tinción de proteínas en geles de poliacrilamida pero sólo unos pocos se han impuesto en electroforesis bidimensional. El más utilizado durante muchos años fue el Coomassie blue pero su limitada sensibilidad (~100 ng) ha hecho que muchos laboratorios se decantaran por la tinción con plata, capaz de revelar cantidades de proteína de hasta menos de 1 ng. La únicas ventajas del Coomassie respecto a la plata son su simplicidad técnica y su respuesta más estequiométrica, que lo hacen más apropiado para la comparación de muestras por análisis densitométrico (la plata presenta una respuesta con saturación y el rango lineal es más estrecho). Además de estos métodos existen colorantes fluorescentes (ej. la serie Sypro, de Molecular Probes) con una sensibilidad comparable a la de la plata y un extenso rango lineal, óptimos para estudios cuantitativos, aunque mucho más caros que otros métodos. Para una buena revisión del tema véase Patton, 2000.

Differential display proteomics.

La electroforesis bidimensional, debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la confección de mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición proteica de un determinado orgánulo o tipo celular. Cuando estos mapas se utilizan para comparar distintas situaciones experimentales, como pueden ser distintas condiciones de cultivo, tratamientos con fármacos o compuestos tóxicos, tejidos sanos o enfermos, líneas celulares normales y tumorales, es cuando la electroforesis bidimensional adquiere toda su funcionalidad (Differential display proteomics). La comparación de imágenes se lleva a cabo mediante software especializado como PDQuest (Bio-Rad Laboratories), ImageMaster 2D Elite (Amersham Pharmacia Biotech), Z3 (Compugen), o Melanie (Geneva Bioinformatics). No merece la pena citar al respecto trabajos concretos ya que prácticamente la totalidad de trabajos publicados se basan en comparación de patrones de spots entre muestras, aunque es interesante citar que prácticamente todos los números de las revistas Electrophoresis, Proteomics y Molecular and Cellular Proteomics contienen artículos sobre electroforesis bidimensional aplicada al estudio del cáncer. Pero, cuál es el criterio para considerar sobre- o infra- expresión comparando mapas bidimensionales? La mayor parte de estudios de expresión que se sirven de cDNA microarrays utilizan umbrales arbitrarios, como el criteiro de doble (sobreexpresión) o mitad (infraexpresión), triple o tercio... Sin embargo, el uso de criterios arbitrarios fold-change conlleva la ineficacia para señalar aquellos cambios sutiles pero que estadísticamente son altamente significativos y medibles con precisión usando réplicas, mientras que otros genes con amplios cambios de magnitud pero elevada variabilidad entre arrays terminan siendo (falsamente) aceptados como positivos (Dopazo, 2001). Respecto al campo de la electroforesis bidimensional, los artículos sobre estos temas son realmente escasos pese a su importancia. La situación es análoga al campo de los microarrays, pero las fuentes de variación no son exactamente las mismas. En primer lugar el procesamiento de las imágenes es más complejo ya que las coordenadas espaciales de los spots son producto de separaciones electroforéticas y están sujetas a variabilidad posicional. El emparejamiento de spots entre geles mediante software especializado cosntituye un verdadero cuello de botella y requiere una intensa supervisión por parte del ususario, ya que el número de spots que pueden emparejarse automáticamente en todos los geles a comparar disminuye dramáticamente al aumentar en número de geles (Voss & Haberl, 2000; Voss et al., 2001). En cuanto a la variabilidad de la intensidad de los spots, se ha descrito, usando como modelo proteínas de hojas de Medicago truncatula, una varianza (CVAR) analítica del 16.2% y una varianza biológica (biógena + analítica) del 24.2% con 10 réplicas, por lo que utilizando el criterio del 95% de confianza las medidas deben variar en un 94.7%, es decir, doble o mitad (Asirvatham et al., 2002). Resultados similares se habían obtenido usando células de cáncer colorectal humano, con coeficientes de variación promedios de entre 20 y 28%. Añadiendo la variabilidad analítica y la intratumoral, el 90% de los CVAR resultaron menores de 48%, sugiriéndose también el uso del criterio de doble o mitad como umbral de significación estadística (Ott et al., 2001).

Por qué proteínas y no simplemente mRNA?

La capacidad de inmobilizar pequeñas cantidades de fragmentos de DNA sobre superficies de vidrio, dispuestos a modo de matriz de alta densidad, supuso una revolución en el análisis de la expresión génica. Las colecciones de sondas, llamadas DNA microarrays, han resultado se herramientas potentísimas capaces de proporcionar información sobre los cambios en los niveles de mRNA de miles de genes simultánemente (cDNA microarrays) entre distintas situaciones experimentales (diferentes líneas celulares, diferentes situaciones fisiológicas o tratamientos). A pesar del indudable valor de las aproximaciones basadas en el uso del mRNA (differential mRNA display, cDNA microarrays, ESTs, SAGE) y del impacto que han tenido en la genómica funcional, la monitorización de la expresión génica directamente a nivel de proteína ofrece una visión más allá de la mera síntesis y destrucción de tránscritos, revelando niveles adicionales de regulación. Esta visión es especialmente atractiva en organismos eucariotas, en que una fracción importante de la regulación de la expresión génica se hace a nivel postrancripcional. Aunque algunos estudios han sugerido la existencia de una buena correlación entre los niveles de mRNA y proteína a partir de experimentos en levaduras (Futcher et al., 1999), análisis más críticos y rigurosos han demostrado que esta correlación aceptable se restringe sólo a las proteínas más abundantes, y mientras que algunos genes de levadura tienen niveles estables de mRNA, presentan variaciones de hasta 20 veces a nivel de proteína, del mismo modo que algunas proteínas con niveles estables presentan variaciones de hasta 30 veces en sus niveles de mRNA (Gygi et al., 1999). Un análisis más reciente describe una correlación altamente significativa en carcinomas transicionales de vejiga con pocas discrepancias, pero se restringe a 40 proteínas abundantes bien focalizadas en 2-D PAGE (Ørntoft et al., 2002), mientras que otro estudio denuncia una situación muy similar a la de Gygi et al. en adenocarcinomas de pulmón, con una correlación significativa entre niveles de mRNA y proteína restringida a sólo 21 de 165 proteínas analizadas (Chen et al., 2002). A estas observaciones se une la inigualable capacidad de la electroforesis bidimensional para descubrir modificaciones postraducionales, siendo por el momento, y probablemente por muchos años más, la única técnica sensible a la vez a cambios en los niveles de expresión, modificación del punto isoeléctrico y modificación del peso molecular de las proteínas, a pesar del creciente desarrollo de otras aproximaciones proteómicas basadas en técnicas cromatográficas acopladas a espectrometría de masas (Rabilloud, 2002).



Referencias

Asirvatham V. S., Watson B. S., Summer L. W. Analytical and biological variances associated with proteomic studies of Medicago truncatula by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proteomics 2002, 2, 960-968.

Berkelman T., Stenstedt T. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients. Principles & methods. Amersham Pharmacia Biotech Inc. 1998.

Chen G., Gharib T. G., Huang C.-C., Taylor J. M. G., Misek D. E., Kardia S. L. R., Giordano T. J., Iannetonni M. D., Orringer M. B., Hanash S. M., Beer D. G. Discordant Protein and mRNA Expression in Lung Adenocarcinomas. Mol Cell Proteomics 2002, 1, 304-313.

Dopazo J. Microarray data processing and analysis. In - Microarray data analysis II -. Kluwer Academic Publ. 2001.

Futcher B., Latter G. I., Monardo P., McLaughin C. S., Garrels J. I. A sampling of the yeast proteome. Mol. Cell. Biol. 1999, 19:11, 7357-7368.

Görg A., Obermaier C., Boguth G., Harder A., Scheibe B., Wildgruber R., Weiss W. The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 2000, 21, 1037-1053.

Gygi S. P., Rochon Y., Franza R., Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol. Cell. Biol. 1999, 19:3, 1720-1730.

Ørntoft T. F., Thykjaer T., Waldman F. M., Wolf H., Celis J. E. Genome-wide study of gene copy numbers, transcripts, and protein levels in pairs of non-invasive and invasive human transitional cell carcinomas. Mol Cell Proteomics 2002, 1, 37-45.

Ott V., Guenter K., Steinert R., Tortola S., Borisch B., Schlegel W., Reymond M. A. Accuracy of two-dimensional electrophoresis for target discovery in human colorectal cancer. Pharmacogenomics J. 2001; 1 (2): 142-151

Patton W. F. A thousand points of light: The application of fluorescence detection technologies to two-dimensional gel electrophoresis and proteomics. Electrophoresis 2000, 21, 1123-1144.

Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics 2002, 2, 3-10.

Voss T., Haberl P. Observations on the reproducibility and matching efficiency of two-dimensional electrophoresis gels: Consequences for comprehensive data analysis. Electrophoresis 2000, 21, 3345-3350.

Voss T., Ahorn H., Haberl P., Döhner H., Wilgenbus K. Correlation of clinical data with proteomics profiles in 24 patients with B-cell chronic lymphocyticleukemia. Int. J. Cancer 2001, 91, 180-186.